DE102005003687A1

DE102005003687A1 - Immunoassay zur Bestimmung der Freisetzung von Neurotensin in die Zirkulation

Info

Publication number: DE102005003687A1
Application number: DE102005003687A
Authority: DE
Inventors: Andrea Ernst
Original assignee: Sphingotec GmbH
Current assignee: Sphingotec GmbH
Priority date: 2005-01-26
Filing date: 2005-01-26
Publication date: 2006-07-27
Also published as: US20080280306A1; ATE433116T1; EP1769250B1; WO2006079528A1; US8637256B2; EP1769250A1; JP5133066B2; JP2008528984A; US20120231475A1; DE502006003868D1

Abstract

Immundiagnostisches Bestimmungsverfahren zur Bestimmung der Freisetzung von Neurotensin in die Säugetier-Zirkulation, bei dem man in einer Serum- oder Plasmaprobe eines Säugetier-Probanden selektiv eine Immunreaktivität des N-terminalen Teils eines Säugetier-Proneurotensins (PNT-Immunreaktivität) bestimmt, die keine Neurotensin- oder Neuromedin-Immunreaktivität ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein für die Routinediagnostik geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Freisetzung des Peptids Neurotensin in die Zirkulation.
Dabei soll vorausschickend angemerkt werden, dass in der vorliegenden Beschreibung Begriffe wie "Diagnostik" bzw. "Routinediagnostik" aus Gründen der Vereinfachung in der Regel in einem umfassenden Sinne verwendet werden, der die Bestimmung der gemessenen Biomoleküle (Peptide) nicht nur für diagnostische Zwecke im engeren Sinne abdecken soll, sondern auch für andere Zwecke wie z.B. zur Bestimmung des metabolischen Zustands eines Probanden vor Beginn einer Therapie oder einer Untersuchung zu diagnostischen Zwecken oder zur Beobachtung und Überwachung eines Patienten über längere Zeiträume, z.B. zur Kontrolle eines Krankheitsverlaufs oder von Therapiemaßnahmen. Auch Bestimmungen zur Forschungszwecken, z.B. im Zusammenhang mit der Entwicklung von Pharmazeutika, z.B. Neurotensinrezeptor-Agonisten, oder von Produkten für die Ernährung, sollen unter den Begriff "Diagnostik" subsummiert werden, soweit das nicht im Einzelfall aufgrund der diskutierten spezielleren Zusammenhänge ausgeschlossen ist.
Außerdem gilt, dass auch wenn die spezielleren Ausführungen zur Erfindung in der vorliegenden Anmeldung insbesondere die Humanmedizin betreffen, Anwendungen auf dem Gebiet der Tiermedizin oder Tierzucht grundsätzlich ebenfalls eingeschlossen sein sollen. So ergibt sich für den Fachmann die Übertragbarkeit der meisten Ausführungen zur vorliegenden Erfindung auf nicht-menschliche Säugetiere, ohne dass umfangreiche Erläuterungen nötig sind. Die analoge Anwendbarkeit des für die Humanmedizin näher beschriebenen Verfahrens auf die Tiermedizin folgt z.B. aus der Bekanntheit der entsprechenden Peptidsequenzen für viele andere Säugetiere, und neben tiermedizinischen Anwendungen sind auch Anwendungen denkbar, die eher die Säugetierzucht betreffen, z.B. als Monitoring des Fütterungszustands und der Futterverwertung von Nutztieren.
Neurotensin ist ein in verschiedenen Geweben und der Zirkulation von verschiedenen Säugetieren, einschließlich des Menschen, vorkommendes Tridecapeptid, dessen Primärstruktur bei allen Säugetieren identisch zu sein scheint. Es weist die Aminosäuresequenz auf, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:2 aufgeführt ist.

Neurotensin wird, wie die meisten biologisch aktiven Peptide (5; Literaturangaben in Form von Zahlen in Klammern beziehen sich auf die beigefügte Literaturliste), durch enzymatische Prozessierung aus einem Vorläufermolekül gebildet, das als Preproneurotensin (mit Signalsequenz) bzw. Proneurotensin (PNT; ohne Signalsequenz) bezeichnet wird. Das Preproneurotensin/Proneurotensin der Säuger enthält neben dem Neurotensin (NT) ein weiteres biologisch aktives Peptid, das Hexapeptid Neuromedin N (NMN; vgl. SEQ ID NO:3). Neurotensin-Vorläuferpeptide wurden u.a. aus Hunde-, Rinder- und Nagetier-Geweben und schließlich auch aus humanen Geweben isoliert. Während die reifen Peptide NT und NMN für verschiedene Säugetiere eine identische Aminosäuresequenz aufweisen, unterscheiden sich die Vorläufermoleküle, d.h. die Prepro- bzw. Proneurotensine, von verschiedenen Säugetier-Spezies bezüglich einer Anzahl von Aminosäuren. So weist das Preproneurotensin der Ratte oder des Rinds z.B. nur 169 Aminosäuren auf, wohingegen das humane Preproneurotensin 170 Aminosäuren aufweist (17).

Die Nukleotid- und Aminosäure-Sequenzen des humanen Preproneurotensins sind seit einigen Jahren bekannt (SEQ ID NO:1; vgl. auch Patent US 6,274,720 B1 ), genau wie die aus Hund (9), Ratte (17) und Rind (17; vgl. auch die Gegenüberstellung verschiedener Preproneurotensinsequenzen in 2 des o.g. US-Patents). Die Aminosäuren 1 bis 23 des Preproneurotensins (SEQ ID NO:1) stellen die sog. Signalsequenz dar.

Die Expression von Proneurotensin erfolgt vorrangig im zentralen Nervensystem (ZNS) und in speziellen enteroendocrinen Zellen, den sogenannten N-Zellen im distalen Dünndarm sowie in Nervenfasern, die den Darmtrakt durchziehen (13). PNT bzw. NT wurden aber auch in den Nebennieren und im Herzgewebe nachgewiesen (24; 23).

Das aus dem Proneurotensin gebildete biologisch aktive Neurotensin (NT) wurde in verschiedenen Säugetier-Geweben nachgewiesen und im Zusammenhang mit zahlreichen unterschiedlichen Funktionen diskutiert. So spielt Neurotensin im Gehirn eine große Rolle als Neurotransmitter und hat analgetische und thermoregulatorische Effekte (6; 8). Des weiteren reguliert NT die Freisetzung der Neurotransmitter Acetylcholin und Glutamat (19; 18), stimuliert die Sekretion von Hormonen der Hypophyse (29) und beeinflusst die Dopamin-Neurotransmission (18), was einen Zusammenhang zur Parkinson'schen Erkrankung nahe legt (28).

Die Sekretion von Neurotensin im Gastrointestinaltrakt wird durch Nahrungsaufnahme stimuliert (15). Dabei kommt es bereits kurz nach dem Essen zu einem signifikanten NT-Anstieg, der über mehrere Stunden erhöht bleibt (14). Es konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von Fett, im Vergleich mit Eiweiß und Glucose, den stärksten Einfluss auf die NT-Produktion hatte (27). Neurotensin stellt offensichtlich eine Art "Sättigungsfaktor" dar, da die Ausschüttung von NT zur Zügelung des Appetits und somit zur Reduktion der Nahrungsaufnahme führt (34). Bei adipösen (fettleibigen) Patienten ist die Plasma-Konzentration des NT im Vergleich zu normalgewichtigen Personen reduziert, was vermutlich zu einem gesteigerten Appetit und einer erhöhten Aufnahme von Nahrung führt (35; 4). Interessanterweise zeigten auch Raucher einen signifikant höheren Anstieg der NT-Konzentration nach Nahrungsaufnahme als Nichtraucher (26). Dies lässt vermuten, dass eine veränderte Neurotensinausschüttung eine mögliche Ursache des gesteigerten Appetits und der häufig zu beobachtenden Gewichtszunahme von ehemaligen Rauchern nach Einstellung des Rauchens ist.

Im Gastrointestinaltrakt stimuliert Neurotensin die Sekretion von Pankreashormonen wie Insulin und Glucagon, inhibiert die Sekretion von Magensäure und stimuliert die Dickdarmmotilität (33). NT fördert das Wachstum von gastrointestinalem Gewebe wie Pankreas-, Dick- und Dünndarmgewebe (12; 36; 10), was die Hypothese nahe legt, dass NT zur Entstehung von Tumoren in diesen Geweben beiträgt.

Die Funktion des zweiten aus dem gleichen Vorläuferpeptid gebildeten Peptids Neuromedin N (SEQ ID NO:3) ist weniger gut charakterisiert. Vermutlich hat es ähnliche Effekte wie das Neurotensin, da beide Ähnlichkeiten in ihrer Aminosäuresequenz aufweisen und an die gleichen Rezeptoren binden (33).

Durch Untersuchung von verschiedenen Gewebeextrakten unter Verwendung von Radioimmunoassays unter Verwendung von Antikörpern, die für freie C-Termini von NT oder NMN spezifisch sind und daher nicht proteolytisch prozessierte Proneurotensin-Formen ohne derartige freigelegte COOH-Temini nicht erkennen, teilweise in Kombination mit HPLC-Techniken zur Auftrennung der Fraktionen nach ihrer Molekülgröße, wurde festgestellt, dass neben NT und NMN bei der Prozessierung von PNT in gewebeabhängiger Weise auch unvollständig gespaltene, sog. große ("large") NT- und/oder NMN-Peptide gebildet werden können (7; 13; 25).

Zahlreiche Untersuchungen befassen sich mit der Bildung bzw. dem Vorkommen von Neurotensin bei verschiedenen Krankheiten, wobei diese Untersuchungen in erster Linie mit Gewebeproben und Gewebeextrakten durchgeführt wurden. Von Untersuchungen, die auf Messungen von Neurotensin in Blutproben von Erkrankten aufbauen, ist z.B. zu nennen, dass die Konzentration von Neurotensin im Plasma von Patienten mit Morbus Parkinson erhöht gefunden wurde (30). Bei Zöliakiepatienten, die eine Unverträglichkeit gegenüber Getreidegluten aufweisen, wurde im Plasma im Vergleich zu Kontrollpersonen im nüchternen Zustand eine erhöhte Neurotensin-Konzentration nachgewiesen (2). Die Plasmakonzentrationen von Neurotensin bei Patienten mit einer Pankreatitis sind nach Einnahme einer Mahlzeit im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen erhöht (22). Bei Schilddrüsenerkrankungen wurden im Plasma von Patienten mit zentraler (oder sekundärer) Schilddüsenunterfunktion signifikant niedrigere Neurotensin-Konzentrationen festgestellt (31). Die sekundäre Schilddrüsenunterfunktion ist bedingt durch eine Störung im Bereich der Hypophyse, welche die Ausschüttung von Schilddrüsenhormonen steuert. Dagegen konnten im Blut von Patienten mit einer peripheren (oder primären) Schilddrüsenunter- bzw. Schilddrüsenüberfunktion im Vergleich mit Kontrollen signifikant höhere Neurotensin-Spiegel (31) festgestellt werden. Bei der primären Schilddrüsenunterfunktion liegt die Ursache in einer Funktionsstörung der Schilddrüse selbst begründet. Patienten mit einer cystischen Fibrose (Mukoviszidose) weisen sowohl vor als auch nach einer Nahrungsaufnahme höhere Neurotensin-Konzentrationen im Plasma auf als gesunde Kontrollpersonen (16, 1; 21).

Zur Bestimmung der Neurotensin-Spiegel in Blut wurden ausnahmslos Assays vom Typ Radioimmunoassay eingesetzt, bei denen die Kompetition des zu bestimmenden Neurotensins in der Probe mit einem zugesetzten markierten Neurotensin oder Neurotensinfragment um die Bindungsstellen eines einzigen Antikörpers bestimmt wird, der eine spezifische Bindung mit Neurotensin bzw. bestimmten Teilsequenzen des freien Neurotensins eingeht, z.B. mit einem freien C-Terminus des Neurotensins. Messungen der NMN-Spiegel wurden auf ähnliche Weise durchgeführt.

Die obigen und ähnliche Ergebnisse zum Vorkommen von Neurotensin bei bestimmten Erkrankungen bzw. die nachgewiesene Stimulierbarkeit der Neurotensinbildung in Abhängigkeit von der Nahrungsaufnahme, die sich außerdem für bestimmte Krankheitszustände als signifikant unterschiedlich erwies, macht die Bestimmung von Neurotensin in Blutproben an sich zu einem vielversprechenden und klinisch vielseitig anwendbaren diagnostischen Hilfsmittel. So erscheint eine solche Bestimmung z.B. im Rahmen der Routineuntersuchung von Patienten, zu ihrer Überwachung während ihrer klinischen Betreuung, zur Kontrolle ihrer Fähigkeit, Nahrung zu verwerten, im Sinne eines Monitorings der Darmfunktionen, oder als therapiebegleitende Maßnahme zur Kontrolle von Therapieerfolgen, wie auch in anderen Zusammenhängen, die sich aus der o.g. Diskussion der wissenschaftlichen Literatur ergeben, einsetzbar.

Neurotensinbestimmungen in Blutproben haben jedoch bisher keinen Eingang in die medizinische Routinediagnostik gefunden. Ein erster wesentlicher Grund dafür liegt in einer für Routinemessungen zu geringen Stabilität der Neurotensinkonzentrationen in Blutproben ex vivo bei Umgebungstemperatur (20) (Halbwertszeit von nur 3 bis 4 h), die in Kombination mit bestehenden Laborlogistiken (von Probenentnahme, Plasmagewinnung, Transport ins Labor bis zur Durchführung von entsprechenden Labortesten) bislang die Verwendung von Neurotensin in der Routinediagnostik verhinderte. Ein zweiter Grund liegt in der bekannten kurzen Halbswertzeit von nur 2 bis 6 min für Neurotensin im Blut in vivo, die auf eine schnelle und effektive Bindung an Neurotensinrezeptoren und/oder einen Abbau des Neurotensins zurück geführt wird (3) und eine Messung mit einer potentiell schwierig einzuschätzenden Zeitabhängigkeit belastet. Momentan messbare NT-Spiegel in Blutproben stellen kein Maß für die gesamte auf einen stimulierenden Reiz, z.B. eine Nahrungszufuhr, bis zum Messzeitpunkt erfolgte Biosynthese und Freisetzung von NT in die Zirkulation dar, sondern repräsentieren eher einen zufälligen Durchgangszustand, bei dem die NT-Eliminierung durch Bindung an Rezeptoren und durch Abbau die Informationen zur Biosynthese und Freisetzung in die Zirkulation massiv verwässert.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine routinetaugliche Möglichkeit zur Bestimmung der Neurotensin-Freisetzung in Proben vom Säugetier-Probanden, insbesondere menschlichen Patienten, zu schaffen, die es ermöglicht, das oben skizzierte Potential einer Bestimmung der Neurotensinfreisetzung für die medizinische Diagnostik auszunutzen und für die medizinisch/klinische Routine umzusetzen.

Diese Aufgabe wird durch ein immundiagnostisches Bestimmungsverfahren zur Bestimmung der Freisetzung von Neurotensin in die Säugetier-Zirkulation gelöst, das in seiner allgemeinsten Form gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet ist, dass man in einer Serum- oder Plasmaprobe eines Säugetier-Probanden selektiv eine Immunreaktivität des N-terminalen Teils eines Säugetier-Proneurotensins (PNT-Immunreaktivität) bestimmt, die keine Neurotensin- oder Neuromedin N-Immunreaktivität ist.

Vorteilhafte Ausgestaltungen eines solchen Verfahrens werden durch die Ansprüche 2 bis 16 in Verbindung mit den Ausführungen zu bevorzugten Ausführungsformen in der Beschreibung wiedergegeben.

Die Aufgabe wird ferner durch einen Kit für eine bevorzugte Ausführungsform eines solchen Verfahrens gemäß Anspruch 1 gelöst, wie er in den Ansprüchen 17 und 18 beschrieben wird.

Nachfolgend werden die der Erfindung zugrunde liegenden neuen Erkenntnisse, und die daraus abgeleiteten erfindungsgemäßen Anwendungen, unter Bezugnahme auf konkrete Versuchsergebnisse und Figuren noch näher erläutert.

Dabei bedeutet "Immunreaktivität des N-terminalen Teils eines Säugetier-Proneurotensins" eine Immunreaktivität, die im Bereich von der Aminosäure in Position 24 (Position 1 nach dem Signalpeptid) bis zur drittletzten Aminosäure vor der ersten Aminosäure des Neuromedin N (Lys) des jeweiligen Säugetier-Preproneurotensins lokalisiert ist. Der angesprochene Bereich umfaßt in allen bekannten Fällen mindestens die jeweiligen Aminosäuren 24 bis 139 bzw. 140, d.h. eine Sequenz, wie sie für das humane Peptide in SEQ ID NO:6 gezeigt ist.

In den Figuren zeigen:
1: Ergebnisse der Messung der ex vivo Stabilität der Immunreaktivität, die N-terminalen Sequenzen des humanen PNT zuzuordnen ist, in aus Probandenblut gewonnenen Serum-, EDTA-Plasma- und Heparin-Plasma-Proben bei Raumtemperatur über Zeiträume von bis zu 7 Tagen;
2: Die Standardkurve eines PNT-Sandwichassays, wie er im experimentellen Teil näher beschrieben wird;
3: Die Ergebnisse der Messung der PNT-Immunreaktivität in Plasma bei normal ernährten Normalpersonen und künstlich ernährten Patienten mittels des beschriebenen Sandwich-Assays;
4: Die Ergebnisse der Messung zeitlicher Veränderungen der PNT-Immunreaktivität im Plasma von normal ernährten Normalpersonen in Abhängigkeit von der Nahrungszufuhr mittels des beschriebenen Sandwich-Assays;
5: Die Ergebnisse der Messung der PNT-Immunreaktivität in Plasma bei normal ernährten Normalpersonen, Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn/Colitis ulcerosa) und Hepatitis-Patienten mittels des beschriebenen Sandwich-Assays.
Zur Überprüfung der Frage, ob bei einer Bestimmung einer Immunreaktivität, die dem N-terminalen Teil des humanen Proneurotensins zuzuordnen ist, und zwar einem Teil, der weder NMN noch NT enthält und bei der proteolytischen Prozessierung unter Bildung von freiem NMN bzw. NT abgespalten wird und dann eine Art Abfallprodukt darstellt, in einer Blutprobe bzw. Serum- oder Plasmaprobe reproduzierbar Ergebnisse erhalten werden können, die den Literaturangaben zum Auftreten von NT entsprechen, wurde ein für diesen N-Terminus des PNT spezifischer Sandwich-Assay entwickelt, wie er im experimentellen Teil näher beschrieben wird. Dieser Assay erkennt spezifisch nur N-terminale Peptide des humanen PNT, die sowohl die Aminosäuren 67 bis 85 als auch die Aminosäuren 121 bis 140 des humanen Preproneurotensins enthalten.
Messungen von humanen Blutproben mit diesem Assay, die nachfolgend in näheren Einzelheiten beschrieben werden, zeigten, dass damit PNT-Immunreaktivitäten gemessen werden, die nach Auftreten und Dynamik die Bildung/Freisetzung von NT widerspiegeln.
Bei der wiederholten Messung von aus derartigen Blutproben gewonnenen Serum- und Plasmaproben bei einer Lagerung bei Raumtemperatur über längere Zeiräume zeigte sich ferner, dass die Stabilität der PNT-Immunreaktivität in Plasma ex vivo überraschend hoch ist. Da selbst nach 7 Tagen noch kein erkennbarer Verlust an bestimmbarer Immunreaktivität feststellbar war, liegt ihre Halbwertszeit bei Raumtemperatur bei weit mehr als 7 Tagen und damit weit über der ex vivo Stabilität des reifen Neurotensins (vgl. 3) bzw. derjenigen eines der großen ("large"), unvollständig prozessierten Proneurotensinpeptide.
Die Ergebnisse der Stabilitätsmessungen sind in 1 gezeigt.
Somit ist die Bestimmung von Proneurotensin bzw. PNT-Fragmenten in Blutproben voll routinetauglich und geeignet, die NT/NMN/PNT-Freisetzungsrate im Blut der medizinischen Routinediagnostik zugänglich zu machen.
Die Herstellung des verwendeten Assays, sein Verwendung bei Messungen sowie die mit ihm erhaltenen Messergebnisse werden im nachfolgenden experimentellen Teil und den Beispielen und den zugehörigen Erläuterungen noch genauer beschrieben.
Experimenteller Teil:
Bestimmung einer N-terminalen Proneurotensinsequenzen zuzuordnenden Immunreaktivität im Plasma
1. Herstellung von Antikörpern
1.1. Immunogene
Es wurden 2 verschiedene Peptid-Teilsequenzen des humanen Preproneurotensins (SEQ ID NO:1), nämlich PNT3 (SEQ ID NO:4) bzw. PNT4 (SEQ ID NO:5), ausgewählt und von der Firma Jerini (Berlin, Deutschland) als synthetische Peptide syntheti siert. Jedes Peptid wurde zusätzlich mit einem aminoterminalen Cysteinrest (Cys0) versehen.
1.2. Antikörpergewinnung
Für Immunisierungszwecke wurden die durch N-terminale Cystein-Reste ergänzten Peptide PNT3 (SEQ ID NO:4) und PNT4 (SEQ ID NO:5) mit dem Hämocyanin aus Limulus polyphemus konjugiert und zur Immunisierung von Kaninchen nach Standardverfahren verwendet, von denen Antiseren gegen die PNT-Peptid-Konjugate gewonnen wurden.
1.3. Reinigung der Antikörper
Die polyklonalen Antikörper der Kaninchen-Antiseren wurden mittels ligandenspezifischer Affinitätsreinigung aufgereinigt. Hierfür wurden die Cys(0)-Peptide PNT3 (SEQ ID NO:4) bzw. PNT4 (SEQ ID NO:5) zunächst an SulfoLink-Gel der Firma Pierce (Boston, USA) gekoppelt. Die Bindung erfolgte nach der Vorschrift des Herstellers wie folgt:
Polycarbonat-Säulen (15mm × 80mm) wurden mit 5ml Affinitätsmatrix befüllt. Nach Äquilibrierung der Säulen mit PBS (136mM NaCl, 1,5mM KH₂PO₄, 20,4mM Na₂HPO₄·2H₂O, 2,7mM KCl, pH 7,2) wurden 5 mg der jeweiligen o.g. Peptide abgewogen, in PBS gelöst, auf die verschlossenen Säulen gegeben, und das Gelmaterial wurde durch Schwenken homogenisiert. Nach 15minütiger Inkubation bei Raumtemperatur und Absetzen des Gelmaterials wurden die Säulen mit 5mal 3ml PBS gewaschen. Zur Absättigung freier Bindungsstellen wurden dem Säulenmaterial je 5ml einer 50mM L-Cysteinlösung hinzugegeben und das Gelmaterial wurde nach Homogenisierung erneut bei Raumtemperatur für 15min inkubiert. Nach Absetzen des Gelmaterials wurde jede Säule mit 6mal 5ml einer 1M NaCl-Lösung gespült und anschließend nochmals mit PBS gespült.
Das Gelmaterial wurde mit 25ml des jeweiligen Kaninchen- Antiserumpools gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken inkubiert. Die Serum-Gel-Gemische wurden in Polycarbonat-Säulen überführt, und überschüssiges Serum wurde entfernt. Die Säulen wurden anschließend mit 250 ml PBS gewaschen, um nicht gebundene Serumproteine zu entfernen. Die Desorption der gebundenen Antikörper erfolgte durch Elution der Säule mit 50mM Citronensäure (pH 2,2). Das Eluat wurde in Fraktionen á 1ml aufgefangen. Die Proteinkonzentration jeder Fraktion wurde mit Hilfe des BCA-Proteinassay-Kits der Firma Perbio (Bonn, Deutschland) bestimmt, und Fraktionen mit einem Proteingehalt > 1mg/ml wurden vereinigt. Die affinitätsgereinigten Antikörper wurden mittels Dialyse in PBS umgepuffert, der Proteingehalt erneut bestimmt. Anschließend wurde bei 4°C gelagert.
2. Assayherstellung
2.1. Festphase
Der affinitätsgereinigte polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen das Peptid PNT3 wurden auf Polystyrolröhrchen (Startubes, 12mm × 75mm, Firma Greiner, Deutschland) immobilisiert. Hierfür wurde die Antikörperlösung auf eine Proteinkonzentration von 6,7 μg/ml mit PBS verdünnt, und davon wurden 300μl pro Röhrchen pipettiert (entspricht 2μg Antikörper pro Röhrchen). Diese wurden für 20h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 3mal mit je 4 ml PBS gewaschen. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Röhrchen bei 4°C gelagert.
2.2. Markierter Antikörper
Der affinitätsgereinigte polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen PNT4 (1mg/ml in PBS) wurde mit Acridiniumester-N-Hydroxy-Succinimid (1mg/ml in Acetonitril, Firma InVent, Hennigsdorf Deutschland) lumineszenzmarkiert. Für die Markierung wurden 200μl Antikörper mit 4μl Acridiniumester gemischt, für 20min inkubiert, und freie Acridiniumesterbin dungen wurden durch Zugabe von 40μl einer 50mM Glycin-Lösung abgesättigt. Der Markierungsansatz wurde mittels HPLC an einer BioSil 400-Gelfiltrations-Säule (Firma BioRad, München, Deutschland) von freiem Acridiniumester getrennt. Als Laufmittel wurde PBS verwendet.
3. Durchführung von PNT-Bestimmungen
3.1. Messbedingungen
Pro Antikörper-beschichtetes Röhrchen (2.1) wurden 50μl einer zu untersuchenden Plasma-Probe sowie 150μl Assaypuffer (PBS-Puffer, 10mM EDTA) pipettiert und 16h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Röhrchen 5mal mit je 1ml PBS gewaschen. Zu den Röhrchen wurden dann je 20 ng des markierten Antikörpers (2.1.) (in 100μl PBS-Puffer, 10mM EDTA) zugegeben. Die Röhrchen wurden für 2h bei RT inkubiert, und anschließend wurde ungebundener Tracer-Antikörper durch 5maliges Waschen mit je 1ml PBS entfernt.
Am Röhrchen gebundener markierter Antikörper wurde mittels Lumineszenzmessung in einem handelsüblichen Luminometer (Berthold LB 952T/16) quantifiziert.
3.2. Kalibrierung
Um die Konzentrationen bzw. Immunreaktivitäten von Proneurotensin in den zu vermessenden Proben bestimmen zu können, wurden 50 EDTA-Plasmen von augenscheinlich gesunden Menschen auf PNT gescreent, und Plasmen mit den höchsten PNT-Immunreaktivitäten wurden gepoolt. Aus diesem Plasmapool wurden mehrere Verdünnungsstufen mit Pferdeserum (Sigma, Deutschland) hergestellt. Dem höchsten Standard (unverdünntes EDTA-Plasma) wurde eine fiktive Konzentration von 100 Units/ml zugeordnet. In 2 ist eine PNT-Standardkurve gezeigt. Die analytische Sensitivität des Proneurotensin-Assays liegt bei ca. 1 U/ml.
4. Ergebnisse von Messungen
4.1. Proneurotensin-Immunreaktivität in Plasmen von augenscheinlich gesunden Menschen
Augenscheinlich gesunde Kontrollpersonen weisen im Blut hohe PNT-Messwerte auf. Es ergibt sich eine Häufigkeitsverteilung, die in 4 gezeigt ist. Der Median wurde mit 35,1 U/ml ermittelt.
4.2. Bestimmung der PNT-Immunreaktivität in der Zirkulation von gesunden Probanden vor, während und nach der Nahrungsaufnahme
Es ist bekannt, dass die Bildung bzw. Freisetzung von Neurotensin durch Nahrungsaufnahme stimuliert wird (15; 14). Um zu ermitteln, ob auch die PNT-Konzentration im Blut von der Nahrungsaufnahme beeinflusst wird, und ob die Dynamik der eventuellen Veränderung der PNT-Immunreaktivität parallel zu der vorbeschriebenen von NT verläuft, wurde folgender Versuch durchgeführt: 6 Probanden (je drei männliche und weibliche Personen) fasteten für 14h. Dann wurde ihnen eine Blutprobe entnommen. Die Probanden nahmen dann zu vorgegebenen Zeitpunkten eine definierte Menge an Flüssigkeit bzw. Nahrung zu sich, und zu bestimmten Zeitpunkten wurden erneut Blutproben genommen wurden. Der Ablauf des Versuchs ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: Ablauf des Nahrungsstimulationsversuchs
Es zeigt sich, dass die Ausschüttung von PNT durch Aufnahme von Flüssigkeit nicht stimuliert wird. Kurz vor der Nahrungsaufnahme, also nach der längsten Fastenzeit, ist die PNT-Konzentration am geringsten. Sie wurde für jeden einzelnen Probanden als 100% definiert, und alle anderen Messpunkte des jeweiligen Probanden wurden auf diesen Wert bezogen. Diese prozentualen Veränderungen der gemessenen PNT-Immunreaktivität der 6 Probanden wurden gemittelt und sind in 3 graphisch dargestellt (P<0,05). Sofort nach dem Essen steigt die PNT-Konzentration im Blut signifikant an. Die letzten beiden Abnahmezeitpunkte 3h und 4h nach der Nahrungsaufnahme weisen die höchsten Messwerte auf. Insgesamt steigt die PNT-Konzentration nach dem Essen um das 4,5- bis 8fache an.
Mit dem o.g. Assay bestimmbare Immunreaktivität, die einem oder mehreren N-terminalen Proneurotensinfragment(en) mit Bindungsstellen für beide verwendeten Antikörper zuzuordnen ist, nimmt somit, wie für das reife Peptid NT beschrieben, aufgrund von Stimulation durch Nahrungsaufnahme zu.
Die Messung von PNT-Immunreaktivität kann somit anstelle des reifen Neurotensins für die Bewertung des metabolischen Status eines Patienten/einer Testperson herangezogen werden.
Durch Gabe einer definierten Menge an Nährstoffen kann die individuelle Stimulierbarkeit der PNT-Freisetzung als Unterschied Δ eines Messwerts zu einem vorgegebenen Zeitpunkt nach der Nahrungsaufnahme und einem Basiswert (z.B. PNT_{3h nach Nahrungsaufnahme} und PNT_nüchtern) oder als Verhältnis bzw. Faktor solcher Werte bestimmt werden. Tabelle 2 zeigt beispielhaft eine entsprechende Auswertung.
Tabelle 2: PNT-Immunreaktivitäten (in U/ml) vor und nach Nahrungsstimulation sowie Angabe von absoluten Differenzen und Faktoren
In der Tabelle bedeuten:

PNT_B: = PNT-Immunreaktivität nach 18 h Fasten (Basiswert)
PNT_5min: = PNT-Immunreaktivität 5 min nach Nahrungsaufnahme
PNT_3h: = PNT-Immunreaktivität 3 h nach Nahrungsaufnahme

4.3. Bestimmung der PNT-Konzentrationen in der Zirkulation von künstlich ernährten Patienten
Wie bereits gezeigt, weisen gesunde Personen eine gewisse PNT-Konzentration im Blut auf, die sich durch Nahrungsaufnahme stimulieren lässt. Bei einer entsprechden Messung der PNT-Immunreaktivität in Plasmen von parenteral (mittels Venenkatheter) künstlich ernährten, zumeist intensivpflichtigen Patienten (z.B. mit einer bestehenden Sepsis oder einem Polytrauma) wurde gefunden, dass diese signifikant niedrigere PNT-Konzentrationen aufweisen als normal ernährte Kontrollen. Bei derartigen Messungen konnte eine um den Faktor 13 verringerte mediane relative PNT-Immunreaktivität von 2,7 U/ml festgestellt werden (siehe 4).
4.4 Bestimmung der PNT-Immunreaktivität in der Zirkulation von Patienten mit inflammatorischen Darmerkrankungen (Morbus Crohn bzw. Colitis ulcerosa)
Bei der Messung von Proben von Patienten mit einer inflammatorischen Darmerkrankung, wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, zeigte sich, dass auch hier die mediane messbare PNT-Immunreaktivität mit 10 U/ml unter der der Kontrollpersonen liegt (5). Einzelne der Patienten wiesen jedoch auch deutlich höhere Messwerte (über 100 U/ml) auf.
4.5 Bestimmung der PNT-Immunreaktivität in der Zirkulation von Patienten mit einer Hepatits A bzw. C
Bei der Messung von Proben von Patienten mit einer Hepatitis A oder C wurden dagegen im Vergleich zu den gesunden Kontrollen höhere PNT-Konzentrationen in der Zirkulation gefunden, mit einem Median von 112 U/ml (5).
5. Isolierung und Charakterisierung von Proneurotensin-Immunreaktivität in Human-Serum
5.1. Herstellung der Affinitätssäule
5mg des aufgereinigten polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen das PNT3-Peptid (SEQ ID NO:4; vgl. 1.1.) wurden nach Vorschrift des Herstellers an 2ml CarboLink-Gel (Firma Pierce, Boston, USA) gekoppelt und in eine Polycarbonatsäule (15mm × 80mm) überführt. Anschliessend wurde das Gel mit 20ml PBS gewaschen.
5.2. Affinitätsreinigung von PNT-Immunreaktivität
Eine Serum-Mischprobe aus 10 individuellen Seren á 100ml mit einer relativen Konzentration von 32 U/ml wurde mit Na-EDTA versetzt (Endkonzentration 10mM) und anschliessend über einen 0,2μm-Filter filtriert. Die aufbereitete Serum-Mischprobe wurde bei 4°C und einer Durchflussrate von 2ml/min sechsmal hintereinander über die Affinitätssäule gepumpt. Anschliessend wurde die Säule mit 50ml PBS gewaschen und die gebundene PNT-Immunreaktivität mit einer 50mM Glycin/HCl-Lösung (pH 2,0) eluiert. Der Säulenausfluß wurde kontinuierlich auf Absorption bei 280nm überwacht und die von der Glycin/HCl-Lösung eluierte Proteinfraktion (Endvolumen 3ml) wurde weiter mittels HPLC analysiert.
5.3. Reversed-Phase-HPLC-Analyse
Das durch Affinitätsreinigung gewonnene Material wurde über Reversed-Phase-HPLC an einer C₁₈-Säule μ Bondapak 0,4 × 30mm der Firma Waters (Eschborn, Deutschland) gereingt. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1ml/min. Die verwendeten Laufmittel und Elutionsbedingungen sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3: Elutionsbedingungen der RP-HPLC von Proneurotensin-IR
Der Säulenausfluss wurde kontinuierlich auf seine Absorption bei 214nm vermessen und in Fraktionen von 0,5ml gesammelt. Mit Hilfe des in den obigen Abschnitten 2. und 3. beschriebenen PNT-Assays wurden diejenigen Fraktionen bestimmt, in denen eine PNT-Immunreaktivität nachweisbar war. Es zeigte sich, dass die Haupt-Immunreaktivität in der Fraktion 67 eluiert wurde.
Die Fraktion 67, die eine positive PNT-Immunreaktivität aufwies, wurde durch Begasen mit Stickstoff getrocknet. Anschliessend wurden die Proben massenspektrometrisch analysiert.
5.4. Massenspektrometrische Analyse
Das Peptid wurde mittels Protease Glu-C bzw. Trypsin verdaut, die entstandenen Fragmente wurden auf an sich bekannte Weise über SMART-HPLC gewonnen und anschliessend massenspektrometrisch untersucht.
Bei der massenspektrometischen Analyse wurde eine Sequenz (SEQ ID NO:6) ermittelt, die vollständig mit der Sequenz der Aminosäuren 24 – 140 des bekannten Preproneurotensins 1-170 (SEQ ID NO:1) übereinstimmte. Damit wurde nachgewiesen, dass im Blut von Menschen ein Proneurotensin-Peptid zirkuliert, das 117 Aminosäuren umfasst und als Preproneurotensin 24-140 zu bezeichnen ist. Es ergab sich keinerlei Hinweis darauf, dass die mittels des beschriebenen Verfahrens als Immunreaktivität bestimmte Spezies noch die C-terminalen reifen Peptide Neuromedin N und Neurotensin enthält.
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Claims

Immundiagnostisches Bestimmungsverfahren zur Bestimmung der Freisetzung von Neurotensin in die Säugetier-Zirkulation, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer Serum- oder Plasmaprobe eines Säugetier-Probanden selektiv eine Immunreaktivität des N-terminalen Teils eines Säugetier-Proneurotensins (PNT-Immunreaktivität) bestimmt, die keine Neurotensin- oder Neuromedin-Immunreaktivität ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Immunreaktivität des N-terminalen Teils des PNT in der Serum- oder Plasmaprobe mit Hilfe von Antikörpern bestimmt, die eine spezifische Bindung mit Teilsequenzen des N-terminalen Teil des PNT eingehen.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die PNT-Immunreaktivität in der Serum- oder Plasmaprobe unter Verwendung von zwei verschiedenen Antikörpern, die spezifische Bindungen mit unterschiedlichen Teilsequenzen des N-terminalen Teils des PNT eingehen, in einem Sandwichassay bestimmt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Säugetier-Proneurotensin humanes Proneurotensin ist, das in humanem Serum oder Plasma bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man selektiv eine PNT-Immunreaktivität bestimmt, die Peptidsequenzen des humanen Preproneurotensins (SEQ ID NO:1) im Bereich der Aminosäuren 24 bis 140 (SEQ ID NO:6) des vollständigen humanen Preproneurotensins zuzuordnen ist.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeich net, dass man die Bestimmung als Sandwichassay mit zwei Antikörpern durchführt, die spezifisch an die Aminosäuresequenzen 67 bis 85 (SEQ ID NO:4) bzw. 121 bis 140 (SEQ ID NO:5) des vollständigen humanen Preproneurotensins (SEQ ID NO:1) binden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper spezifische monoklonale und/oder affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass einer der Antikörper durch Immunisierung eines Tiers mit einem Antigen erhalten wird, das eine synthetische Peptidsequenz enthält, die die Aminosäuren 67 bis 85 (SEQ ID NO:4) des humanen Preproneurotens (SEQ ID NO:1) umfaßt, und der andere der Antikörper durch Immunisierung mit einem Antigen erhalten wird, das eine synthetische Peptidsequenz enthält, die die entsprechenden Aminosäuren 121 bis 140 (SEQ ID NO:5) umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass einer der Antikörper in festphasengebundener Form eingesetzt wird, und der andere Antikörper markiert ist oder selektiv markierbar ist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung des markierten oder zu markierenden Antikörpers eine Markierung mit einem Radiosiotop, einem Chemilumineszenz-, Biolumineszenz-, Fluoreszenz- oder Enzymlabel zur Anwendung kommt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl der erste als auch der zweite Antikörper in einer flüssigen Reaktionsmischung dispergiert eingesetzt werden und daß an den ersten Antikörper eine erste Markierungskomponente gebunden ist, die Teil eines auf Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Löschung oder -Verstär kung beruhenden Markierungssystems ist, und daß die zweite Markierungskomponente dieses Markierungssystems an den zweiten Antikörper gebunden ist, so dass nach Bindung beider Antikörper an das nachzuweisende Proneurotensin ein messbares Signal erzeugt wird, das eine Detektion der gebildeten Sandwichkomplexe in der Messlösung ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungssystem Seltenerdkrypate oder -chelate in Kombination mit einem Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Farbstoff, insbesondere von Cyanintyp, umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es als Point-of-Care-Verfahren unter Verwendung einer immunchromatographischen Messvorrichtung durchgeführt wird und als Label zur Markierung ein direkt visuell detektierbares Label verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Überwachung des Ernährungsstatus und/oder der Verdauungsfunktionen eines Patienten durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Patienten künstlich ernährte Patienten sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung im Zusammenhang mit der Diagnose, Verlaufskontrolle oder Therapie unter Einsatz von Proben von Patienten erfolgt, die an Erkrankungen leiden, die ausgewählt sind aus Morbus Parkinson, Zöliakie, chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa), Darmkrebs oder Krebs der Bauchspeicheldrüse, Pankreatitis, Schilddrüsenerkrankungen, cystischer Fibrose und Hepatitis.
Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 3 bis 12 und 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass er neben üblichen Hilfsreagenzien wie Puffer- und Waschlösungen mindestens umfaßt: – ein erstes Immunreagens, das einen ersten spezifischen Antikörper gegen eine Teilsequenz des humanen Proneurotensins in festphasen-immobilisierter Form umfaßt, – ein zweites Immunreagens, das einen zweiten spezifischen Antikörper gegen eine Teilsequenz des humanen Proneurotensins in solubilisierter und markierter Form umfaßt, sowie – Standard- und Eichlösungen, die definierte Mengen eines Peptidpräparats enthalten, das Bindungsstellen für den ersten und zweiten spezifischen Antikörper aufweist.
Kit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase die Wand eines Teströhrchens ist und der zweite Antikörper mit einer Chemilumineszenzmarkierung markiert ist.