JP2002527753A

JP2002527753A - 敗血症及び敗血症様全身性感染の診断及び治療のための方法及び物質

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Publication number: JP2002527753A
Application number: JP2000576286A
Authority: JP
Inventors: アンドレアス・ベルグマン; ヨアヒム・シュトルック; ヴォルフガング・ヴェクレーナー
Original assignee: ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・ディアグノスティカ・ゲーエムベーハー
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1999-10-13
Publication date: 2002-08-27
Anticipated expiration: 2019-10-13
Also published as: DE59915190D1; US20090233311A1; JP4444507B2; US8691512B2; JP2009235090A; JP5219939B2; ATE417860T1; DE59913233D1; US20090098571A1; US7972799B2; JP2009269920A; US20090215076A1; EP1408334B1; US7498139B2; WO2000022439A2; EP1121600A2; DE59914077D1; ATE475889T1; US7723492B2; JP4510920B2

Abstract

(57)【要約】敗血症疾患の診断及び治療、及び、プロカルシトニン以外のプロホルモン並びにジペプチジルペプチダーゼIVの測定における、並びに、敗血症の診断でのバイオマーカーとしての、組み換えプロカルシトニン３−１１６の使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、敗血症及び敗血症様全身性感染において、プロカルシトニン又はプ
ロカルシトニンの部分ペプチド（partial peptides）の発生に関係する、新規な
、実験的に確認された発見から導かれる、新規な診断及び治療の可能性に関する
。

【０００２】

【従来の技術】

特許DE 42 27 454及びEP 0 656 121 B1及びUS 5,639,617は、敗血症の危険を
有する患者及び敗血症の典型的な症候が見られる患者の血清又は血漿中のプロホ
ルモンのプロカルシトニン及びそこから得られる部分ペプチドの測定が、早期検
出にとって、すなわち敗血症に至らしめるかもしれない感染の検出及び非感染性
の病因との鑑別、重大性の検出、及び、敗血症及び敗血症様全身性感染の治療の
成果の評価にとって、有益な診断手段であること開示している。前記測定は、全
身性微生物感染に起因する症状を非感染性の病因の他の症状から区別するための
診断に特に有益であることが証明されており、該非感染性病因の他の症状とは、
敗血症を示唆するかもしれないが、実際には全身性微生物感染に起因しないもの
であって、それらの臨床像によるが、例えば、個々の器官の非感染性炎症から、
術後の拒絶反応又はガンまでの症状である。さらに、全身性炎症は局所性炎症と
は区別され得る。

【０００３】より最近の発見の概要としては、W. Karzaiらのin Infection, Vol 25 (1997)
, 6, 329-334頁及びそこに引用もしくは言及されている更なる技術文献を参照す
ることができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】

プロカルシトニンは、カルシトニンのプレホルモンとして既知となっており、
その完全なアミノ酸配列は古くから知られている（FEBS 167 (1984), 93-97頁）
。プロカルシトニンは、甲状腺のＣ細胞において、通常の状態で産生されており
、それから、特異的開裂によってホルモンのカルシトニンになり、さらに、部分
ペプチドのカタカルシン及び５７のアミノ酸を含むN−末端残基（「アミノプロ
カルシトニン」）となる。

【０００５】敗血症の間のプロカルシトニンの生成に重要である器官もしくは細胞又は組織
に関する実験資料によってサポートされているものもいくつか存在する前記技術
文献中には異なる意見もあるが、敗血症のケースでは、甲状腺を完全に除去した
患者からでさえも、著しく高いプロカルシトニンレベルが観察されることもある
ので、敗血症患者の血中に検出可能なプロカルシトニンが、甲状腺の外で形成さ
れると結論付けることが必要であった。

【０００６】敗血症において「プロカルシトニン」として測定されるペプチドの性質に関し
て、実際、その特定のペプチドが、甲状腺においてカルシトニン前駆体として形
成される完全な長さの既知のプロカルシトニンと完全に同一である必要はないこ
とは、上述の患者におけるアウトセットから明らかにされている。しかしながら
、敗血症のケースで形成されるプロカルシトニンが甲状腺で形成されるプロカル
シトニンと異なるのかどうかという疑問は、現在まで答えが得られていない。あ
り得る違いは、既知のプロカルシトニンの、糖化（グリコシレーション）、リン
酸化あるいは一次構造の修飾等の翻訳後の修飾、さらに、変性した、短くされた
あるいは長くされたアミノ酸配列であった。今日まで分析アッセイ方法は、カル
シトニン前駆体として既知のプロカルシトニンと、敗血症の場合に形成されるプ
ロカルシトニンとの間の違いを明らかにしなかったので、敗血症のケースで形成
されるプロカルシトニンは、カルシトニン前駆体と同一であり、ゆえに、既知の
１１６アミノ酸のプロカルシトニン配列を有するペプチド（プロカルシトニン１
−１１６）であると暫定的、一般的に見なされていた。

【０００７】しかしながら、出願人の研究室における測定によって明らかにされ、本出願の
実験部分により詳細に説明されているように、敗血症のケースで形成されるプロ
カルシトニンは、甲状腺で形成される完全なプロカルシトニン１−１１６とは、
わずかだが重大な違いがある。見出された違いは、それから、新規な診断及び治
療方法、そこで使用可能な物質、及び、遂行され得る科学的アプローチにおいて
実施可能な多数の科学的結論を導き出した。

【０００８】本出願において開示される発明の開始点は、敗血症及び敗血症様全身性感染の
ケースにおいて患者血清中に比較的高濃度で検出可能なプロカルシトニンが、１
１６のアミノ酸を含む完全なプロカルシトニン１−１１６ではなく、そのアミノ
末端がジペプチド分短くなっているが他は同一であり、１１４のアミノ酸のみの
アミノ酸配列を有するプロカルシトニン（プロカルシトニン３−１１６）である
という驚くべき発見である。

【０００９】完全なプロカルシトニンと比べて欠落している前記ジペプチドは、Ala-Pro構
造を有している。完全なプロカルシトニン配列のアミノ末端の二番目のアミノ酸
としてのプロリン残基を含むジペプチドの欠落は、特定のペプチダーゼ、すなわ
ち、いわゆるジペプチジル−（アミノ）−ペプチダーゼIV（DP IV又はDAP IV又
はCD 26）が、敗血症のケースで検出されるプロカルシトニン３−１１６の生成
に役割を果たすかもしれないという推測を導く。

【００１０】全身性感染又は敗血症と関連してジペプチジル−（アミノ）−ペプチダーゼIV
の可能な役割を決定するために、発明者は実験により、前記生理的DAP IV濃度と
敗血症の検出と相関関係があるのかどうかについての試験を行っている。得られ
た結果は相関関係を示した。

【００１１】より正確に得られた結果はさらに、敗血症及び全身性感染のケースの高濃度の
プロカルシトニンの発生は孤立した現象ではなく、同様に、他のプロホルモンも
また高濃度で測定可能であり、その結果、そのようなプロホルモンの測定が、プ
ロカルシトニン測定に代えて可能であるか又は個々のケースのプロカルシトニン
測定を補足するか、もしくは、さらにそれを診断上の意義のある方法で確認する
のに適している、という仮説の展開をもたらした。

【００１２】敗血症のケースの患者血清中に見出されるのが、完全なプロカルシトニン１−
１１６ではなく、短くなったプロカルシトニン３−１１６であるとの発見も、敗
血症治療にとって潜在的な興味ある問題である。Eric S. Nylenらの論文Crit Ca
re Med 1998, Vol.26, No. 6, 1001-1006頁は、プロカルシトニンが炎症反応を
維持し且つ増強しうるという事実に基づいて、敗血症のケースで生じているプロ
カルシトニンが、例えば代謝排泄物として形成される、診断上重要なマーカーで
あるというだけでなく、感染によって引き起こされる炎症過程におけるメディエ
ーターとしての活性な役割を果たしているらしいことを示す、実験による発見を
記載している。プロカルシトニンのこの役割は現在、論争の課題であり、その開
示された試験結果は同意できる説明を与えていない。

【００１３】アミノ末端でアミノ酸２つ分短くされたプロカルシトニンが敗血症のケースで
生じているという上述の発見は、敗血症及び他の炎症性全身性感染のケースで活
性な役割を果たすプロカルシトニンがおそらくこの短くされたプロカルシトニン
３−１１６であり、また、完全な長さのプロカルシトニンペプチドを用いて行わ
れた研究が、とりわけこの理由で、異なった又は矛盾した結果を与えたことを示
唆している。多数の生理活性ペプチドが、開裂、例えば短いペプチド残基の最初
の脱離、によってそれらの実際の活性形態に変換されることは周知である。既知
の例はアンギオテンシンであり、著しく異なった生理活性を有するペプチドが、
最初にテトラペプチド、次にジペプチド、そして最後に単独のアミノ酸の、連続
的な脱離によって、１４のアミノ酸を有する不活性なアンギオテンシノーゲンか
ら形成される。その生理活性ペプチドのN−末端の比較的わずかな変更が、免疫
学的過程で役割を果たし、対応するペプチドの活性にかなりの変化をもたらすこ
とができるという事実は、ごく最近の数多くの出版物によって確認されているが
、敗血症の病理的プロセスに対する言及はなされていない（例えば、J. Immunol
1998, Sept. 15, 161 (6): 2672-5; Biochemistry 1998, Sept. 8, 37 (36): 1
2672-80; FEBS Lett 1998, July 31, 432 (1-2): 73-6; L. Biol Chem 1998, Ma
rch 27: 273 (13): 7222-7; J Exp Med 1997, Dec 1: 186 (11): 1865-72）。

【００１４】

【発明の実施の形態】

プロカルシトニン３−１１６が実際に炎症過程と関連し、特異的分子レセプタ
ー又は類似した特異的バインダーがこの短くされたプロカルシトニンに対して存
在するのであれば、プロカルシトニン３−１１６の使用、又は、プロカルシトニ
ン３−１１６のレセプターと相互作用するアゴニスト及びアンタゴニストの使用
によって、敗血症の進行に影響を与え、それがきっかけとなって起こる生理反応
に、そして炎症過程にも影響を与えることができる新規な治療の可能性が開かれ
る。プロカルシトニン３−１１６の特異的バインダー、例えば、選択的抗体、の
使用は、ここで伝えられる発見によって明らかにされる治療アプローチでもある
。

【００１５】結局、敗血症及び全身性感染のケースでジペプチジル−アミノペプチダーゼIV
がプロカルシトニン３−１１６の生成に役割を果たすかもしれないということは
、更なる仮説、すなわち、例えば適当な選択的バインダー、抗体又は類似のレセ
プター分子によってそれをブロックすることによりジペプチジル−アミノペプチ
ダーゼIVの活性に影響を与え、それによって、敗血症及び敗血症様炎症過程に治
療上の影響を与えることも可能かもしれないという仮説を導く。

【００１６】この特許出願の目的は、特許法下において、上述の新規な発見及びそこから導
かれる結論から生じる新規な技術的教示を、現状の知識水準を考慮した上で、特
許保護に到達可能な範囲まで保護することである。

【００１７】特許請求の範囲は、そのような保護可能な教示を暫定的に要約している。当業
者にとっては、実験セクションで述べられる実験条件と実験結果、及び、それに
関連した説明を考慮した本出願の完全な本文から、さらなる保護可能な教示が生
じるかもしれない。そのような教示の特許請求に関しては、補足的な請求項によ
って明らかに権利が保持される。

【００１８】その新規な発見を支持するか又はそこから導かれる仮定の正しさを証明する、
選択された実験材料は、いくつかの図を参照して以下に示される。

【００１９】図１は、HPLCによる、様々な重度の敗血症患者から集められた血清をプールし
た血清からのプロカルシトニンの単離及び精製の結果を示す。図２は、高いプロカルシトニン免疫反応性を有する、図１からのプール血清の
各フラクションの質量分光分析結果を示す。図３は、敗血症血清及び正常な血清中のジペプチジル−アミノペプチダーゼIV
の酵素活性の測定結果を示す。図４は、敗血症血清及び正常な血清中のプロカルシトニンの測定結果を、同じ
血清中のさらなるプロホルモン、すなわちプロ−ガストリン放出ペプチド（proG
RP）の測定結果と比較して示す。図５は、健常者２０人のグループと敗血症患者２０人のグループの血清中のプ
ロカルシトニンの測定結果を示す。図６は、図５と同じ健常者と敗血症患者の各グループにおける、pro-ANFの測
定結果（pg／チューブ）を示す。図７は、図５と同じ健常者と敗血症患者の各グループにおける、pro-ADMの測
定結果（pg／チューブ）を示す。図８は、図５と同じ健常者と敗血症患者の各グループにおける、pro-ENDの測
定結果（pg／チューブ）を示す。図９は、図５と同じ健常者と敗血症患者の各グループにおける、pro-BNPの測
定結果（pg／チューブ）を示す。

【００２０】

【実施例】

実験セクション A. 敗血症患者の血清からの内因性プロカルシトニンペプチドの単離と確認重度の敗血症に苦しむ複数の患者からの血清サンプルを混合することによって、
総容量６８mlの混合血清が調製された。得られたプール血清中のプロカルシトニ
ン濃度は、市販のプロカルシトニンアッセイ（LUMItest PCT, B.R.A.H.M.S. Dia
gnostica）を用いて測定したところ、２８０ng/ml（総量１９μg）であった。前
記プール血清は、同量のバッファー（６８ml；１０mM EDTA、１mg/mlマウス−Ig
G、２mg/ml ヒツジ−IgG、２mg/mlウシ−IgG、０．１mmolロイペプチン、PBS中
５０μMアマスタチン）と混合し、そのサンプル中に含まれるプロカルシトニン
を、アフィニティークロマトグラフィーによって単離及び精製した。

【００２１】このために、全てのプールサンプルを、０．５ml/minの流速で４回、連続して
、アフィニティーカラム（０．５×１cm、抗カルシトニン抗体、PierceからのCa
rbolinkに結合、プロカルシトニン結合容量約２０μg）に送った。それからその
カラムを３０mlのPBSで洗浄し、結合したペプチドを、５０mM酢酸（pH約２．０
）を用いて溶離させた。カラム流出物を２８０nmでの吸収を用いて持続的にモニ
ターし、酢酸によって溶離したタンパク質フラクションを集めた（最終容量２．
０ml）。

【００２２】この方法で集められた物質は、rpC₁₈ カラムμBondapak ０．４×３０mm（Wat
ersより）での逆相HPLCによって精製した。その流速は１ml/minであり、移動相
及び溶離条件は以下の表１に示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】そのカラム流出物は、２１４nmでの吸収によって持続的に測定され、０．２５
mlのフラクションが集められた。市販のプロカルシトニンアッセイ（LUMItest P
CT, B.R.A.H.M.S. Diagnostica）を用いて、PCT免疫反応性を検出できたフラク
ションを決定した。主要な免疫反応性を有する部分が、シャープなバンドとして
５１番目のフラクションに溶離したことが見出された。加えて、不均一な組成及
び低いＰＣＴ免疫反応性を有するタンパク質フラクションが、３９から４９のフ
ラクションにて得られた。

【００２５】図１は、前記rp HPLCの、集められた各フラクションについて決定され、溶離
したフラクションの吸光度（OD）を示す曲線に重ね合わせたPCT免疫反応性（ng
PCT/mlで表される）を示す。

【００２６】ポジティブなプロカルシトニン免疫反応性を有する全てのフラクションを、窒
素ガス処理によって乾燥させた。その後、それらのサンプルをマススペクトロメ
トリーで分析し、N−末端塩基配列決定を行った。

【００２７】前記マススペクトロメトリー分析（MSLDI-TOF法）では、図２に示されるプロ
ファイルが、フラクション５０−５２に対して得られ、そのプロファイルから、
１２６４０±１５のモル質量という結果となった。マススペクトロメトリーで調
べられた他のフラクション（３６−４９、５３−５９）はすべて、１２６４０未
満のモル質量で不均一な質量分布を示した。それらの個々の質量は、フラクショ
ン５０−５２の質量の強度と比べて２％未満の強度を与えた。このように、敗血
症患者血清中のプロカルシトニン免疫反応性が、１２６４０±１５の質量と関連
があることが示された。

【００２８】フラクション３６−５９中に含まれるペプチドのN−末端塩基配列決定を行っ
た。ここでも、フラクション３６−４９及び５３−５９の内容が不均一であると
証明された。すなわち、N−末端の多様性が測定された。

【００２９】その優勢なプロカルシトニン免疫反応性がわかったフラクション５０−５２で
は、そこに含まれるペプチドが明らかに以下のN−末端（１５のアミノ酸）： Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu を有することが明らかになった。

【００３０】それから、フラクション５０−５２からのペプチドは、プロテアーゼGlu-C又
はトリプシンを用いて消化され、得られたフラグメントは、SMART-HPLCによって
それ自身は既知である方法で元に戻され、それから、マススペクトロメトリーと
配列分析によって調べられた。

【００３１】既知のプロカルシトニン１−１１６のアミノ酸３−１１６の配列と完全に対応
した配列が得られた。その配列の理論上の質量は１２６２７であったが、これは
マススペクトロメトリーにより測定された１２６４０±１５の質量と一致する。

【００３２】したがって、１１４のアミノ酸を含み且つプロカルシトニン３−１１６として
デザインされたプロカルシトニンペプチドが敗血症患者の血液中を循環すること
が示された。そのペプチドは、リン酸化又はグリコシル化等の翻訳後の修飾によ
って変化しない。

【００３３】前記プロカルシトニン３−１１６は、可能性のある内因性プロカルシトニン部
分ペプチドとしては、現在に至るまで科学論文で論じられておらず、それゆえに
、当業者にとって、今日までに、具体的に、このペプチドを調製し、その性質に
ついてそれを調べる理由もない。しかしながら、上記発見は、今や、遺伝子工学
技術によって前記プロカルシトニン３−１１６の具体的な調製の理由をもたらし
ている。その調製は以下に記載される。

【００３４】Ｂ．組み換えプロカルシトニン３−１１６のクローニング、発現及び精製１．クローニングプロカルシトニン３−１１６（以下、PCT 114と略す）をコードするDNAフラグ
メントを、適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR増幅によって、ヒ
ト甲状腺cDNAプールから単離した。望ましいフラグメントが通常の手法（Ausube
l FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA及びStruhl K (
1991), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Yo
rk）によってクローニングされ、その正確なヌクレオチド配列がDNA塩基配列決
定と、プロカルシトニンをコードする既知のDNA配列との比較とによって確かめ
られた。

【００３５】 PCT 114をコードするcDNAの発現にはベクターが用いられた。これは、T7プロ
モーターと、いわゆるpelBタンパク質のシグナルペプチドをコードする領域を含
んでいる。このpelBシグナルペプチドは、クローニング及び発現後に形成される
融合タンパク質が、発現に用いられたホスト細胞の細胞質を通ってそのペリプラ
ズム部分に輸送されることを保証する。この輸送過程では、そのN−末端シグナ
ルペプチドが、膜上に位置するシグナルペプチダーゼによって、同時に分離され
る（Stader JA及びSilhavy TJ (1990), Engineering Escherichia coli to secr
ete heterologous gene products, Methods Enzymol. 185, 166-187）。この手
順は、見出された発現生成物が正確に望ましい配列を有することを保証する。こ
の手順では、他の発現方法では必要とされるN−末端メチオニンは存在しない。

【００３６】前記タイプのベクターへのPCT 114用のcDNAのクローニング、及びこのベクタ
ーによるE. coliの形質転換の後、プロカルシトニン３−１１６が発現した。発
現したプロカルシトニン３−１１６を有するペリプラズムフラクションが、それ
自身は既知の方法で単離した（Neu HC及びHeppel LA (1965), The release of e
nzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during the formation o
f spheroblasts, J. Biol. Chem. 240, 3685-3692）。遠心（１００，０００ｇ
、３０分、４℃）、及び、その上澄み液（０．２μm）のろ過の後、得られたろ
液をアニオン交換クロマトグラフィーによって分離した。プロカルシトニン免疫
反応性を有するフラクションは、敗血症血清からのPCT３−１１６の単離に関し
て記載されたように、合わされて、逆相HPLCによって精製された。

【００３７】プロカルシトニン免疫反応性を有するすべてのフラクションは、合わされて、
凍結乾燥された。SDS-PAGEを用いてその物質をチェックすることによって示され
るように、つまり、得られる物質は少なくとも純度９５％である。

【００３８】プロカルシトニン３−１１６として発現し、精製されたペプチドの同一性は、
マススペクトロメトリーと配列分析によって確認された。

【００３９】得られた組み換えプロカルシトニン３−１１６は、新規な組み換えペプチドで
あり、この形態で、免疫試薬の調製に用いられることができ、また、治療上の適
性、あるいは、上述の出版物（Eric S Nylen, Loc. cit.）との関係で、予防上
及び治療上の活性を有するその能力について調べられることができる。

【００４０】 PCTアッセイ用の標準物質の調製のために、上述した、遺伝子工学によるプロ
カルシトニン３−１１６の調製方法が、また、完全なプロカルシトニン１−１１
６及びプロカルシトニン２−１１６の調製にも本質的に同一の形態で用いられた
。

【００４１】 C. 通常のヒト血清及び重度の敗血症患者からの血清中におけるジペプチジル−
アミノペプチダーゼIV（DAP IV）活性の測定健常者から、及び、敗血症患者からの、それぞれ２０の血清サンプルを、それ
らのジペプチジル−アミノペプチダーゼIV特異的酵素活性について調べた。この
DAP IV酵素活性は、Lys−Pro−４−メトキシ−ベータ−ナフチルアミドを用いる
それ自身は既知の方法で、フルオロメトリーによって測定した。このために、各
ケース、２μlの血清が３mlの基質（５０μg/ml Lys−Pro−４−メトキシ−ベー
タ−ナフチルアミド、５０mM Tris/HCl、pH７．５）を用いてテストされ、３４
０nmの波長を有する光による励起で生じた蛍光は、４１０nmの放射波長で持続的
に測定された。その蛍光シグナルは、４−メトキシナフチルアミン溶液を用いて
校正された。この方法で決定された酵素活性は、nmol/minで記載される。

【００４２】得られた結果を図３に示す。

【００４３】敗血症血清中のDAP IV酵素活性が実質的に、健常者血清（血液提供者の血清）
中の活性よりも低いことは明確である。つまり、血漿又は血清中のDAP IV酵素活
性の決定は、患者血清中の敗血症を検出するために用いることもできる。

【００４４】敗血症のケースでの、実質的に減少したDAP IVの血漿濃度は、一方では、該DA
P IVが敗血症のプロセスに関与している証拠として考えることができる。他方で
は、それらの結果は、プロカルシトニン３−１１６の形成に責任があるのが血漿
中のDAP IV濃度ではないことを示している。どちらかといえば、得られた結果は
、プロカルシトニン３−１１６が、おそらく細胞内で、組織又は細胞結合DAP IV
によって形成され、プロカルシトニン生成細胞又はプロカルシトニン貯蔵細胞か
ら遊離されるという結論を示唆している。

【００４５】 DAP IVが活性化Ｔ細胞から発現するという効果についての文献（cf. Hegen及
びOravecz, Protein Reviews on the WEB; Fleischer, loc. cit.）に含まれる
情報は、DAP IVの発現と免疫系の活性状態との間の密接な関係を示しており、こ
れは、敗血性全身性感染のケースでは過剰なストレス下にあり、それゆえに、と
りわけプロカルシトニン３−１１６の形成が非常に増加するという、それら自身
を表す典型的な反応を示す。

【００４６】上述の発見から生じる可能性とは別に、敗血症診断の過程でのDAP IVの測定に
とって、上述の結果はまた、敗血症においてカスケード様の様式で生じるプロセ
スがDAP IVインヒビターによって治療上の影響を受け、その結果、敗血症下での
プロカルシトニン３−１１６及び他のホルモンあるいは変換されたプロホルモン
の遊離を予防又は減少させることが可能であろうということを示し、このプレホ
ルモンの遊離に対して、減少又は予防されるべきという病理学的結論を可能にし
ているのかもしれない。

【００４７】 D. 敗血症のケースにおけるプロカルシトニン以外のプロホルモン濃度の測定敗血症のケースで放出されるのが完全なプロホルモンのプロカルシトニンでは
なく、Xaa-Proジペプチドの分短くなった変性プロホルモンであるという事実は
、敗血症のケースで放出されるのはプロカルシトニン３−１１６だけではなく、
プロカルシトニン３−１１６は単に、例えば、免疫調節能を有するものであり、
敗血症のケースではおそらく変換形態で高度に遊離されるプロホルモン又は同様
のペプチド全体の中の代表的な１つにすぎないという仮説を導く。

【００４８】既知のプロホルモン及びこれらのプロホルモンに関する文献に述べられるアミ
ノ酸配列のチェックによって、事実上最も良く知られたプロホルモンが、そのア
ミノ末端に、Xaa-Proと定義されることができ且つそれゆえにプロカルシトニン
の場合に見られたのと同様に除去され得るジペプチドを有することが示された。
特に、前記タイプのジペプチドは数多くのプロホルモン又は免疫調節体（immuno
modulators）のアミノ末端に存在する。下記の、表の形態の文献データのリスト
は、いくつかの選択されたプロホルモン又は免疫調節体、それらのアミノ末端に
見出されるジペプチド、及び、それらのアミノ酸総数の概要を示す。

【００４９】表２に示されるプロホルモンは、敗血症のケースで濃度が上昇するかもしれな
いプロホルモンの例であるが、そのリストは網羅的なものとみなされるべきでは
ない。免疫調節体の場合、ジペプチドの脱離はその活性に影響するであろう。

【００５０】

【表２】

【００５１】今日までの実験による発見は、敗血症等の全身性感染のケースでは、一般的に
、インターロイキン等のプロホルモン及びペプチド免疫調節体が、おそらく、ア
ミノ末端でのジペプチドの脱離による変性を伴って遊離されること、並びに、こ
れらがおそらく、関連する特定のレセプター又はその他のバインダーとの相互作
用によって、免疫応答のカスケード内の更に次のステップを開始させること示す
。

【００５２】通常の血清と敗血症患者からの血清におけるプロカルシトニン決定と平行して
、他のプロホルモンの決定も行った。これらは公平に、ランダムに選択された。
これらは、(i)プロ−ガストリン放出ペプチド（proGRP）、(ii)プロ−心房性ナ
トリウム排泄増加性ペプチド（pro-ANP又はpro-ANF）、(iii)プロ−アドレノメ
デュリン（pro-adrenomedullin, pro-ADM）、(iv)プロ−エンドセリン（pro-END
）及び(v)プロ−脳ナトリウム排泄増加性ペプチド（pro-BNP）であった。

【００５３】 D.1. 敗血症患者からの血清及び健常者からの血清中のproGRPの決定アッセイは、proGRP決定用のものが市販されている。近年の出版物に、proGRP
が気管支の小細胞癌の腫瘍マーカーとして記載されている（Petra Stieber et a
l., J Lab Med 1997, 21 (6): 336-344）。proGRPの決定用アッセイは、トーネ
ンコーポレーションのProGRP ELISA KIT^TMの名称のものが市販されている。

【００５４】このキットを用い、この市販のキットの使用のための情報にて指定された手順
に従って、図４に示す測定結果が得られた。

【００５５】プロカルシトニン及びproGRPについて得られた値の比較は、正常な血清と敗血
症の血清との間の差違が、プロカルシトニンの場合よりも明確であること、しか
し該proGRP濃度がプロカルシトニンの濃度と同様に上昇することを示している。

【００５６】 D.2. 敗血症患者からの血清及び健常者からの血清中のpro-ANF、pro-ADM、pro-
END及びpro-BNPの決定プレホルモンであるpro-ANF、pro-ADM、pro-END及びpro-BNPの決定については
、アッセイは、DRG（DRG Instruments GmbH, D-35018 Marburg, ドイツ）からキ
ットの形態で市販されており、製造者の指示に従って次の測定に用いられた。

【００５７】特に、以下のものが用いられた。

【００５８】 pro-ANFの決定には、Prepro-ANF 26-55（ヒト）RIAキット；pro-ADMの決定に
は、Pro-Adrenomedullin 45-92 （ヒト）RIAキット；pro-ENDの決定には、Prepr
o-Endothelin 18-50（ヒト）RIAキット；及び、pro-BNPの決定には、Prepro-BNP
22-46（ヒト）RIAキットであり、これらは上述のDRG社のものである。

【００５９】２０人の正常者A-Tの群の血清及び敗血症患者２０人の血清において、上述の
プロホルモンと、それらと同時に、プロカルシトニンとを決定した。その結果は
以下の表３に要約されている。表３のデータは、図５から９にグラフでも示して
いる。

【００６０】示された結果は、正常者に比べると、敗血症患者のケースでは、測定されたプ
ロホルモン全ての値でおおよそ明確な増加を示すが、正常者と敗血症患者の間の
差違はプロカルシトニンの決定において最も際立っている。

【００６１】補足的な文献検索によって、さらに、敗血症性ショックにおけるプロ−オピオ
メラノコルチン（POMC）関連ペプチドの確認に関する出版物J. Endocr. (1988)
119, 159-165頁が明らかになった。該出版物は、敗血症性ショックにおける内因
性オピオイド活性の増加に関する疑問、及び、ステロイドの投与による選択性の
影響を検討している。感染プロセスの直接の影響又は抗生物質による測定値の影
響は論じられていない。前記出版物における問題に基づいては、他のプロホルモ
ンペプチドを含む報告結果の一般化された議論について、論理的な実現可能性は
ない。ここに開示される本発明の教示に照らすと、前記出版物は、敗血症のケー
スにおける一般的なプロホルモンの増加をさらに示したものとして回顧的に解釈
することができる。

【００６２】さらなるプロホルモンをテストすることは、ここに開示された結果を見ると決
まり切った測定であると見なされるべきであり、もしそのようなテストがポジテ
ィブな結果を導き、それによってさらなるプロホルモン決定が敗血症の診断に用
いられるのであれば、本出願の教示の使用によるものであるであろう。

【００６３】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 HPLCによる、様々な重度の敗血症患者から集められた血清をプー
ルした血清からのプロカルシトニンの単離及び精製の結果

【図２】高いプロカルシトニン免疫反応性を有する、図１からのプール血
清の各フラクションの質量分光分析結果

【図３】敗血症血清及び正常な血清中のジペプチジル−アミノペプチダー
ゼIVの酵素活性の測定結果

【図４】敗血症血清及び正常な血清中のプロカルシトニンの測定結果を、
同じ血清中のさらなるプロホルモン、すなわちプロ−ガストリン放出ペプチド（
proGRP）の測定結果と比較

【図５】健常者２０人のグループと敗血症患者２０人のグループの血清中
のプロカルシトニンの測定結果

【図６】図５と同じ健常者と敗血症患者の各グループにおける、pro-ANF
の測定結果（pg／チューブ）

【図７】図５と同じ健常者と敗血症患者の各グループにおける、pro-ADM
の測定結果（pg／チューブ）

【図８】図５と同じ健常者と敗血症患者の各グループにおける、pro-END
の測定結果（pg／チューブ）

【図９】図５と同じ健常者と敗血症患者の各グループにおける、pro-BNP
の測定結果（pg／チューブ）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/37 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者ヴォルフガング・ヴェクレーナードイツ・Ｄ−12099・ベルリン・ローレンツヴェーク・２Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA01 CA04 DA06 GA11 HA03 HA11 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ36 QR48 QR58 QS36 QX02 4B064 AG15 CA02 CA19 CC24 DA15 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA36 EA52 FA73 FA74 GA23 HA05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】敗血症及び重度の感染、特に敗血症様全身性感染の、鑑別診
断的早期検出、並びに、重症度の評価及びその治療処置の達成度の評価のための
検出方法であって、プロカルシトニン以外の少なくとも１つのペプチドプロホル
モンの含量、及び／又は、それから導かれる部分ペプチドであって前記ペプチド
プロホルモンから得ることのできる成熟ホルモンではない部分ペプチドの含量が
、患者の生理的流体サンプル中で測定され、敗血症又は敗血症様感染の存在、そ
の重症度、及び／又は、治療処置の達成度が、測定された前記ペプチドプロホル
モンの存在及び／又は検出量から決定することを特徴とする方法。
【請求項２】前記ペプチドプロホルモンが、プロ−ガストリン放出ペプチ
ド（proGRP）、プロ−エンドセリン−１（pro-END）、プロ−脳ナトリウム排泄
増加性ペプチド（pro-BNP）、プロ−心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド（pro
-ANP又はpro-ANF）、プロ−レプチン、プロ−ニューロペプチド−Ｙ、プロ−ソ
マトスタチン、プロ−ニューロペプチド−ＹＹ又はプロ−アドレノメデュリン（
pro-ADM）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】ジペプチジル−アミノペプチダーゼ（DP IV又はDAP IV又はC
D 26）によってジペプチドがペプチドの末端から切り取られ得るために、そのア
ミノ末端で該ジペプチドを欠くことによって既知の完全なペプチドプロホルモン
とは異なる部分ペプチドが、測定によって検出されることを特徴とする請求項１
又は２記載の方法。
【請求項４】前記ジペプチドが、Xaa-Proジペプチドであり、Xaaが完全な
プロホルモンペプチドのアミノ末端アミノ酸であることを特徴とする請求項３記
載の方法。
【請求項５】前記ペプチドプロホルモンの前記測定がイムノアッセイ又は
沈降アッセイとして行われ、且つ、敗血症又は重度の敗血症様感染の存在の診断
が、測定された該ペプチドプロホルモン濃度が、健常者に見られる同じプロホル
モンの値よりも有意に高い場合に行われることを特徴とする、請求項１から４の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項６】敗血症及び重度の感染、特に敗血症様全身性感染の、鑑別診
断的早期検出のため、検出のため、及び、重症度の評価のため、及び、その治療
処置の達成度の評価のための方法であって、ジペプチジル−ペプチダーゼIV（DP
IV；ジペプチジル−アミノペプチダーゼIV；DAP IV又はCD 26）が患者血清又は
血漿中で測定され、且つ、敗血症又は敗血症様全身性感染の存在が、健常者と比
べて有意に減少しているジペプチジル−ペプチダーゼIVの濃度に基づいて診断さ
れることを特徴とする方法。
【請求項７】遺伝子工学によって調製されたプロカルシトニン３−１１６
。
【請求項８】遺伝子工学によるプロカルシトニン３−１１６の調製方法で
あって、 −プロカルシトニン３−１１６の１１４のアミノ酸をコードしているcDNAを適当
なベクターに挿入し、 −形成した該ベクターを用いて、適当なホスト細胞を形質転換させ、プロカルシ
トニン３−１１６を発現させ、 −前記ホスト細胞を刺激し、 −発現したプロカルシトニン３−１１６を含むフラクションを回収し、そして、
−前記フラクションから、遺伝子工学によって調製された生成物として、クロマ
トグラフィーによる精製によって、少なくとも９０％の純度で前記プロカルシト
ニン３−１１６を得ることを含む方法。
【請求項９】プロカルシトニンアッセイにおける標準物質として、又は、
敗血症及び敗血症様全身性感染の予防及び処置のための治療の準備のための、組
み換えプロカルシトニン３−１１６の使用。
【請求項１０】症状とは無関係な診断上のパラメーターとしてのプロカル
シトニン３−１１６の測定方法。